關於NET和敗血症的關係，以及抑制TREM1如何透過NET減緩敗血症的發生

在敗血症的發展過程中，中性粒細胞的活化會導致內皮細胞（Endothelial Cell，簡稱EC）功能異常，部分原因是由中性粒細胞外膜陷阱（Neutrophil Extracellular Trap，簡稱NET）的釋放所致。而Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cell-1，簡稱TREM-1是一種孤兒免疫受體，通過增強Toll-like Receptor-4(TLR4）的介導的炎症反應。儘管已知TLR4信號在NETosis中扮演關鍵角色，但TREM-1在該過程中的作用尚未得到深入研究。近期的一項研究揭示了TREM-1如何通過抑制NETosis減緩敗血症的發生。

該研究報告了TREM-1在人類和小鼠中性粒細胞中增強NET的釋放，並成為NET結構的一部分。相反，通過藥物抑制或遺傳學剔除TREM-1可以減少體外NETosis，同時在體內實驗性敗血性休克過程中也可以降低NETosis的發生。此外，孤立的NETs能夠活化EC並損害血管反應性，而TREM-1的抑制可以減輕這些有害影響。因此，TREM-1可能成為一個新的治療靶點，以預防NETosis和相關的內皮功能異常。

總之，這項研究為我們提供了有關NET和敗血症之間關係的新見解，同時也介紹了通過抑制TREM-1來減緩NETosis，進而預防敗血症發生的方法。未來，我們或許能夠利用這些發現，開發更有效的治療策略，以幫助敗血症患者減輕相關的疾病風險。

敗血症, 內皮細胞, 中性球, 和NET之間的關係

敗血症是由於對感染的非正常宿主反應引起的致命性器官功能失調，並且仍然是全球死亡的主要原因之一。宿主反應涉及中性粒細胞的活化以及中性粒細胞介導的內皮屏障完整性受損，這些因素共同促使末端器官功能失調。

中性粒細胞對入侵微生物的主要反應包括產生反應性氧化物（Reactive Oxygen Species，簡稱ROS）、釋放細胞因子以及將病原體吞噬到吞噬體中。活化的中性粒細胞還可以排出與組織蛋白連接的核DNA，形成稱為中性粒細胞外膜陷阱（Neutrophil Extracellular Traps，簡稱NETs）的細胞外結構。NET釋放（NETosis）是一個主動的過程，與凋亡或壞死不同。中性粒細胞形成NET的機制取決於刺激的性質。這些刺激涉及多條路徑，最終導致組蛋白修飾、染色質脫凝、核信封的喪失、核內容與細胞質顆粒蛋白的混合、膜完整性的喪失，最終導致中性粒細胞外結構的釋放。因此，NETs可能是雙刃劍：一方面，NETs構成了有效的抗微生物防禦；另一方面，它們是具有免疫效應和促炎功能的分子的來源，這些分子參與了敗血性休克的病理生理過程。

敗血症的一個特點是內皮功能異常，這導致血栓形成和血管反應性異常，並且炎症反應的擴大與粘附分子過度表達、白細胞交通增加以及NET過度形成相關。NETs及其成分，尤其是組蛋白，可能會增強炎症過程，誘導內皮細胞活化，通過破壞黏連蛋白結合位點，促進內皮屏障功能障礙，因此可能調解微血管滲漏。此外，循環的無細胞DNA、髓過氧化物酶-DNA（MPO-DNA）和精氨酸化組蛋白H3（Cit-H3）已被證明與敗血性休克患者的器官功能嚴重程度和28天致死率呈正相關。

免疫受體髓細胞表達的觸發受體1（Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cell-1，簡稱TREM-1）在增強炎症反應方面起著關鍵作用，它與其他模式識別受體（如Toll様受體）合作。TREM-1的表達已在不同細胞類型中觀察到，如中性粒細胞、成熟單核細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞、血小板和內皮細胞。TREM-1的結構包括三個不同的區域：一個免疫球蛋白（Ig）樣結構、一個跨膜部分和一個短的細胞質尾部。為了進行信號傳導，TREM-1通過一個負電荷（−）的天門冬氨酸與跨膜區域內的一個正電荷（+）的賴氨酸之間的靜電相互作用與免疫受體酪氨酸基激活基序包含的輔助蛋白（DAP12）相關聯。TREM-1受激活後，TREM-1與TLR激活相互作用，最終導致炎症反應的增強。

Fortin等人首次顯示，在TLR4激活後，TREM-1和TLR4共同定位於GM1脂質漂浮區，這一現象被認為有助於細胞外和細胞內TLR4和TREM-1途徑介質的組裝。這種組裝導致多種信號傳導分子（Lyn、AKT、ERK1/2和Jak2）的磷酸化和ROS的誘導。這些研究結果在其他研究中得到了進一步證實，同時這些細胞內途徑也在NETosis中發揮了重要作用。

我們最近的研究顯示，藥物抑制TREM-1（使用合成肽LR12）或內皮細胞中TREM-1的基因消除可以減少中性粒細胞浸潤、血管內皮功能異常以及各種實驗性敗血性休克模型中的死亡。

考慮到TREM-1和TLR4信號途徑之間的緊密聯繫，TLR4激活對NET生成的影響，以及NET在敗血性休克早期階段中通過促進內皮活化和功能異常的有害作用，我們假設TREM-1在NET生成方面發揮作用，或增強了NET的有害效應。因此，我們研究了TREM-1活化對NET生成、NET介導的內皮細胞活化和血管功能障礙的影響。該研究揭示了敗血性休克過程中NETosis的新機制。

TREM-1活化增強NET生成

本研究首先確定了從人類中性粒細胞中誘導最大NET釋放的理想濃度和時間。儘管低濃度的脂多糖（LPS）沒有或僅有微弱的效果，但10μg/ml的LPS能夠強烈誘導NET的形成，在3小時達到最大值（圖1a）。在存在PMA的情況下觀察到類似的模式（圖1b），盡管NET形成仍然低於LPS刺激。接下來，我們研究了TREM-1活化對LPS介導的NETosis的影響。人類中性粒細胞在αTREM-1（10μg/ml）的刺激下，與或不與LPS（10μg/ml）一同刺激3小時，而αTREM-1單獨引發的反應非常微弱，但它增強了LPS誘導的NET釋放（圖1c）。相反，通過使用抑制性肽hLR12來抑制TREM-1活化，減少了LPS誘導的NET產生（圖1d）。為了排除LR12或αTREM-1的潛在非特異性影響，我們研究了小鼠中性粒細胞中的NETosis。藥物抑制TREM-1（使用mLR12），以及基因消除（Trem1-ko），都導致LPS誘導的NET產生減少（圖1e）。單獨使用hLR12對NETosis沒有影響（未顯示的數據）。對人類中性粒細胞的瓜氨酸化組蛋白H3（Cit-H3）的西方墨點分析確認了hLR12誘導的對LPS介導NETosis的減少（圖1f）。最後，我們檢查了TREM-1是否是NET的組成部分。分離的NET的西方墨點分析顯示TREM-1的存在（圖1f）。這一結果在共軛焦顯微鏡下得到了證實：LPS誘導的NETs被觀察到，它們是由外源性DNA組成的類似網狀的結構，上面有外源性的Cit-H3和TREM-1（圖1g）。

TREM-1抑制減少NET誘導的內皮細胞活化

我們檢查了分離的NETs（來自LPS活化的人類中性粒細胞）是否能夠激活內皮細胞。高通量人類肺微血管內皮細胞（HPMECs）在與NETs（10μg/ml）進行共同培養的情況下被刺激6小時。流式細胞分析顯示，NETs上調了ICAM-1、E選擇素、VCAM-1和TREM-1的表達。這種上調在一定程度上被hLR12所阻止（圖2），除了VCAM-1（圖2）。相反，hLR12單獨對HPMECs沒有影響（未顯示的數據）。

這些結果表明，NETs能夠以TREM-1依賴的方式激活內皮細胞，因為TREM-1的抑制減少了內皮細胞的活化。

TREM-1抑制減少NET誘導的血管功能障礙

接下來，我們檢查了NET對血管功能的影響，以及藥物抑制或基因消除TREM-1的影響。為了評估血管的反應性，我們從WT-L和Trem1-ko小鼠的主動脈和腸系膜動脈中提取，並與從LPS活化的小鼠中性粒細胞分離的NET進行共同培養。NETs嚴重損害了兩種類型血管的收縮和鬆弛功能（圖3a，b）。雖然mLR12對NET誘導的收縮功能損害的影響較小，但它幾乎完全恢復了內皮依賴性的鬆弛功能。此外，Trem1基因敲除也能保護免受NET誘導的血管功能障礙的影響（圖3c，d）。

iNOS和COX-2的過度表達在介導血管功能障礙方面至關重要。西方墨點分析顯示，NETs上調了主動脈和腸系膜動脈中這兩種蛋白的表達，而這種上調在基因或藥物TREM-1抑制下被阻止（圖3e，f）。

藥物抑制TREM-1在體內減少NET的釋放

正如之前所描述的，我們觀察到，在LPS注射後6小時，可溶性TREM-1的濃度在血漿和肺組織匀浆中均增加（圖4a，b）。為了評估敗血症動物血漿中的NET釋放，我們測量了循環的游離細胞DNA（圖4c）和MPO-DNA（圖4d）。由於肺在敗血症過程中是一個主要的靶器官，我們還通過測量肺組織匀浆中的Cit-H3和PAD4的表達來間接確定肺部NET的形成（圖4e）。需要注意的是，Cit-H3和PAD4被認為是敗血症嚴重程度的標誌。雖然LPS增加了血漿和肺部的NET釋放，但這一效應被TREM-1抑制所阻止。

TREM-1參與NETosis的關鍵步驟

NETosis機制包括幾個關鍵步驟，包括鈣離子流入、ROS生成和PLCγ的磷酸化、ERK1/2的磷酸化以及SYK的磷酸化。為了研究TREM-1途徑激活如何增強LPS誘導的NETosis，我們使用載有fluo-3的人類原始中性粒細胞和流式細胞分析來評估細胞內鈣離子的釋放。如之前所述，TREM-1活化在LPS活化的中性粒細胞中誘導細胞內鈣離子的釋放（圖5a），而hLR12減少了這一效應。作為對照和結果的正規化，我們使用了thapsigargin，它通過抑制SERCA（肌肉內質網鈣運輸ATP酶）泵增加細胞質鈣離子濃度（未顯示的數據），並使用ionomycin作為離子載體誘導最大響應。在檢測ROS生成時也觀察到了相同的反應模式（圖5b）。這些結果表明，活化的TREM-1誘導細胞內鈣離子流入和ROS生成，而TREM-1抑制減少了這些效應。為了進一步驗證TREM-1途徑激活在LPS誘導的NETosis中的參與，我們通過西方墨點分析量化了p-SYK/SYK、p-PLCγ/PLCγ和PAD4。我們觀察到，在αTREM-1的孵育下，SYK和PLCγ的磷酸化增加，相較於僅LPS刺激（圖5c，d）。αTREM-1也增加了LPS活化的中性粒細胞中PAD4的表達（圖5e）。這些結果證實，TREM-1活化增強了在TLR4參與後與NETosis相關的關鍵途徑的激活。

血液中TREM1的含量和COVID預後間的關連性

在這份研究中，研究人員探討了免疫受體Myeloid細胞表達的觸發-1（TREM-1）的血漿可溶性形式（sTREM-1）濃度與住院COVID-19患者預後之間的關聯性。TREM-1在細菌感染性疾病中被激活，並放大炎症反應。一些小型研究表明，TREM-1可能參與病毒感染，包括COVID-19。這項研究的目標是解析sTREM-1的血漿濃度是否能預測住院COVID-19患者的預後。

研究方法涉及一個在法國的3所大學醫院進行的多中心前瞻性觀察性研究。納入了確診SARS-CoV-2感染的住院患者。在進入ICU的患者（ICU群：ICUC）或住院在醫學病房的患者（傳統群：ConvC）的血漿中，測量了sTREM-1的濃度，分別在入院時和第4、6、8、14、21和28天測量。他們記錄了臨床和生物學數據，並對患者進行了90天的隨訪。對於醫學病房的患者，如果需要提高氧供應> 5 L/min，轉入ICU或死亡，則其預後被認為是複雜的。對於重症監護室（ICU）的患者，複雜的預後是指在ICU內死亡。

結果顯示，納入時的sTREM-1血漿濃度在ICU患者（n = 269）中高於醫學病房患者（n = 562）（224 pg/mL（IQR 144-320）對147 pg/mL（76-249），p < 0.0001），且在兩個群中的預後複雜的患者中更高：178（94-300）對135 pg/mL（70-220），p < 0.0001在醫學病房患者中，以及342（288-532）對206 pg/mL（134-291），p < 0.0001在ICU患者中。較高的sTREM-1基線濃度是複雜結局的獨立預測因子（hazard ratio（HR）= 1.5（1.1-2.1），p = 0.02在醫學病房患者中；HR = 3.8（1.8-8.0），p = 0.0003在ICU患者中）。在傳統病房的患者中，224 pg/mL的sTREM-1血漿濃度具有42％的敏感性和76％的特異性，可用於複雜的預後。在ICUC中，287 pg/mL的截斷值對死亡具有78％的敏感性和74％的特異性。在傳統病房的患者中，sTREM-1濃度隨時間增加並與複雜的預後相關（p = 0.017），但在ICU患者中則未見此情況。

總之，在COVID-19患者中，sTREM-1血漿濃度是預後的獨立預測因子，盡管其正確和錯誤的可能性比值不足以作為單獨的標記來指導臨床決策。

Method

NET release

Human neutrophils were isolated as previously described and stimulated with LPS (10 μg/ml) or PMA (50 nM) for different time periods (0.5, 1, 2, 3, 4, or 6 h) with or without hLR12 (25 or 50 mg/ml) coincubation.

Neutrophils were isolated from WT-L and Trem1-ko mice, stimulated with LPS (10 μg/ml) or PMA (50 nM) and incubated with mLR12 (25 mg/ml) for 3 h.

All cells were incubated at 37 °C in 5% CO2 in the dark.

A single concentration of the agonist anti-TREM-1 (αTREM-1) (MAB1278, Biotechne, R&D Systems, USA) (10 μg/ml) was administered to LPS-stimulated human neutrophils to evaluate the effect on NET release. DNA generation was examined by measuring the green fluorescence as previously described. An isotype-matched antibody was used as a negative control.

NET collection

NETs from LPS-activated neutrophils were collected as previously described.31 Briefly, freshly isolated human or murine neutrophils were plated in 6-well culture plates (2.5 × 106 cells/ml) and stimulated with LPS (10 μg/ml) for 3 h at 37 °C and 5% CO2. The culture medium was then carefully removed, and each well was washed twice with 1 ml of cold phosphate-buffered saline (PBS). The wash solution containing NETs was then centrifuged at 450 × g for 10 min to remove the cells. The collected supernatant containing the NETs was further centrifuged at 16,000 × g for 10 min to pellet the NETs. After removing the supernatant, the pellet containing the NETs was resuspended in fresh RPMI containing 2% fetal bovine serum (FBS). The isolated NETs were stored at −20 °C until use. NETs were also collected from untreated neutrophils. NETs were analyzed for LPS contamination by a Chromogenic Endotoxin Quant Kit (Thermo Fisher Scientific, Illkirch-Graffenstaden, France) according to the manufacturer’s instructions. We found an acceptably low level of LPS (≤3.37 EU/ml) in the collected NETs.

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